miRNA - kleine RNA-Schnipsel regulieren die Gen-Expression

miRNA - Genprodukte der "nicht-codierenden" DNA

 

Die Verschwendung im menschlichen Genom mutet gigantisch an: Nur etwa zehn Prozent der Erbsubstanz entsprechen Regionen, die den Bauplan von Proteinen kodieren. Mehr und mehr stellt sich nun jedoch heraus, dass auch nicht-kodierende Abschnitte nicht nur unnötiger Ballast sind, der sich im Laufe der Evolution angesammelt hat, wie Gerümpel in den Kellerverschlägen unserer Behausungen. Ein nicht unwesentlicher Teil dieser nicht-kodierenden Teile der DNA werden in sogenannte microRNA ( miRNA, miR) umgeschrieben und aus dem Zellkern ausgeschleust.

 

miRNA regeln die Genexpression

 

Diese miRNAs spielen eine wichtige Rolle in der Genexpression: Sie heften sich dazu an Teile der mRNAs (messenger RNAs. Sie sind die Kopien der kodierenden DNA-Abschnitte und übersetzen mithilfe der Ribosomen die auf ihnen abgespeicherten Codes in die entsprechenden Eiweißketten) und sorgen damit entweder für einen Kettenabbruch während der Proteinsynthese, oder aber die mRNAs werden bei diesem Vorgang zerschnitten und damit unbrauchbar gemacht. Speziell das Stummschalten von mRNA geschieht mithilfe solcher miRNA-Sequenzen, die oft aus nicht mehr als 21 bis 25 Nukleotiden bestehen.

Etwa 20 bis 30 Prozent der Gene könnten so reguliert sein. Bis heute haben Forscher schon 1.200 solcher hochkonservierter miRNAs isoliert, beschrieben und in Datenbanken gesammelt.

 

PCR - Königsweg für miRNA

 

Diese kurzen Nukleotidketten sind ganz besonders anfällig für Verdauung, was die Arbeit mit ihnen erschwert. Doch lassen sie sich mittels der PCR (Polymerase Chain Reaction), einer seit langer Zeit gut etablierten DNA-Synthese-Reaktion, leicht in die wesentlich stabilere cDNA umschreiben.

Die miRNAs finden ihre Hauptaufgabe in der Zelle dann, wenn Zellteilung, Zelldifferenzierung oder Zelltod (Apoptose) anstehen. Aber auch ihre Beteiligung an der Tumorbildung wird diskutiert. Darüberhinaus sind sie auch in die Aufrechterhaltung der Pluripotenz und der Selbsterneuerung von Stammzellen involviert.

Viele Gründe also, auf diesem Gebiet intensiv zu forschen.

Ein weiterer Grund hat vor längerem schon den Arbeitskreis von Prof. Dr. Thorsten Koslowski am Institut für Physikalische Chemie der Universität Freiburg auf den Plan gerufen. Die Forscher hier interessieren sich ganz besonders für die elektrischen Eigenschaften einer Untergruppe der miRNA, den Riboswitches. Diese kommen ausschließlich in Prokaryoten vor und regeln dort die Genexpression. Dabei reagieren sie auf die Konzentration spezifischer Metabolite, für die sie eine substratspezifische Erkennungsstelle haben. Eine zweite Domain in ihrer Nukleotidkette bindet an die entsprechende mRNA und beeinflusst so den Zusammenbau der dazugehörenden Eiweißkette.

 

Riboswitches - »Antikörper« aus RNA

 

Die Riboswitches binden an ihre Metaboliten so stark und spezifisch wie Antikörper an ihre Antigene. Weil sie aber viel einfacher zu synthetisieren sind als Antikörper, setzt die medizinische Forschung mehr und mehr auf sie. Wieder ist hier die PCR der ausschlaggebende Punkt. Sie funktioniert heute einfach noch zuverlässiger und schneller als entsprechende Proteinsynthesen.

 

Aptamere - synthetische Riboswitches

 

Darüberhinaus existiert eine weitere Methode, die den Pool von natürlich vorkommenden "RNA-Antikörpern" fast unbegrenzt mit synthetischen Produkten erweitern kann.

SELEX heißt das Verfahren, an dessen Ende ein hochspezifisches sogenanntes Aptamer steht. Und das für fast jedes denkbare Target-Molekül. Dazu erstellt man zunächst große Zufallsbibliotheken von Oligonukleotiden unterschiedlicher Basenabfolgen mit einer Kettenlänge von 40 bis 70 Basen. Diese bringt man anschließend mit den gewünschten Target-Molekülen zusammen, die im Ansatz in immobilisierter Form vorliegen. Behandelt man diesen Ansatz mit einer Waschlösung, bleiben nur RNA-Ketten mit hoher Affinität zu der immobilisierten Struktur zurück. Diese werden anschließend von den Targets abgelöst und per PCR vervielfältigt. Die so gewonnene Auswahl wird erneut den Target-Molekülen ausgesetzt. Wieder werden die am stärksten bindenden selektiert. Nach mehreren dieser Zyklen liegt dann ein hochspezifisches Aptamer vor.

 

Aptamere - synthetische »Antikörper« und Sensoren

 

Wofür das alles? Solche Aptamere sind nicht nur hervorragende "Antikörper«, sondern sie sind auch aussichtsreiche Kandidaten für Sensorsysteme.

Denn Computer-Simulationen am Physikalisch-Chemischen Institut ergaben, dass diese Molekül-Aptamer-Komplexe wie Charge-Transfer-Systeme reagieren. Dabei hüpfen oder tunneln Elektronen (Hopping oder Superexchange) von einem Nukleotid zum nächsten, von einem Potentialtopf in den nächsten, wobei die gestapelte Anordnung der Nucleotide und die damit einhergehende elektronische Kopplung ihrer Pi-Orbitalsysteme dieses Hüpfen erst möglich macht. Das Dipolmoment der sie umgebenden Wassermoleküle tun das Seinige dazu. Zusätzlich sorgt das Target-Molekül in der Bindungstasche der Oligonukleotid-Kette dafür, dass die Nukleotide enger zusammenrücken, und sich dabei weite Lücken schließen und Energiebarrieren flacher werden.

Die Computersimulationen am Freiburger Institut haben gezeigt, dass speziell Target-Moleküle mit aromatischen Ringstrukturen - Farbstoffmoleküle wie Malachitgrün, Alkaloide und viele andere Metabolite mit einer solchen Ringstruktur, stabile Addukte mit "ihrem" Aptamer formen. Diese Addukte beeinflussen die Charge-Transfer-Kinetik und die Mobilität der Ladungsträger stark und erzeugen so Leitfähigkeiten von einigen Nanoampere im einzelnen Aptamer-Target-Komplex.

 

ein Aptamer-Sensor im Rotlicht

 

Deshalb können solche Aptamer-Sensoren als schaltbares Elektronen-Übertragungssystem fungieren, bewirkt durch die Konformationsänderungen vor und nach der Target-Bindung.

Dabei verringert das Target-Molekül den Abstand zwischen einer Elektrode und dem Ladungs-Donor, wobei ein Strom induziert wird, der auf mikroskopischem Level gemessen werden kann.

Schon nanoskopische Anordnungen solcher Nukleotid-Ketten zeigen eine Konduktivität von etwa 10 nA bei außen angelegter Spannung von einem Volt.

Wie ein solcher Sensor realisiert werden könnte, zeigt Maria Schill, Diplomantin im Arbeitskreis mit folgendem Modell aus einem Aptamer A und seinem Target-Molekül T, sowie einem zweiten DNA-Fragment D mit einer Bindungsstelle für einen lichtsensitiven Ruthenium-Komplex C. (siehe Abbildung):

 

Aptamere vom Reißbrett

 

Auch wenn die in Freiburg gemachten Computersimulationen noch experimentell verifiziert werden müssen, haben sie im Bereich der DNA-Leitfähigkeit schon bewiesen, dass mit ihrer Hilfe verlässliche Vorhersagen zu treffen sind.

Die Hoffnung besteht, dass diese Simulationen nicht nur die Charge-Transfer-Prozesse existierender Aptamer-Target-Komplexe berechnen können, sondern auch dabei helfen werden, neue Aptamere »am Reißbrett« zu planen und zu optimieren, die beide Eigenschaften in sich vereinigen: die spezifische Kopplung an das Target - bei gleichzeitig hoher Leitfähigkeit.

 

 

Der lichtsensitive Komplex C bindet spezifisch an das DNA-Fragment D. Rotlicht sorgt in diesem Komplex dann für eine Ladungstrennung, wobei die positive Ladung durch die Aptamer-Kette A und seinem Targetmolekül T läuft, die D mit der Kathode verbrückt. Um diesen Ladungsfluss auszubalancieren, diffundiert gleichzeitig der Ruthenium-Komplex als C- zur Anode.
In Abwesenheit des Targetmoleküls nimmt die Leitfähigkeit des Aptamers so stark ab, dass die lichtinduzierte Ladungstrennung rekombiniert, bevor ein Strom fließen kann.

 

 

 

 

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